嫦娥科研速报｜一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶解淀粉芽孢杆菌GZU05及其应用方法-获发明授权，已实现实体转化
专利名称：一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶解淀粉芽孢杆菌GZU05及其应用方法
专利号：ZL 2019 1 0025309.9
专利摘要：本发明制备的GZU05对底物银杏黄酮的转化效果显著，发酵方法工艺简单，降低生产成本，且酶对环境耐受力强，适合大规模连续化生产；同时，该酶还可用于将银杏黄酮苷转化为苷元，并生产高值的纳豆激酶，具有很好的应用前景。由本发明制备的纳豆激酶活力高，且感官性能良好，易于被大众接受，对防治心脑血管疾病都具有重要作用。
专利核心：纳豆激酶；解淀粉芽孢杆菌；高活性；防治心血管疾病
专利介绍：
1.技术领域
本发明涉及微生物，还涉及酶，进一步来说涉及解淀粉芽孢杆菌，涉及解淀粉芽孢杆菌的应用方法。
2.背景技术
β‑葡萄糖苷酶(β‑D‑Glucosidase，EC3 .2 .1 .21)，是一类来源广泛的水解酶类。其特性是可水解结合于末端非还原性的β‑D‑葡萄糖苷键，同时释放出β‑葡萄糖和相应的配基。β‑葡萄糖苷酶可由酵母，曲霉、木霉、细菌等产生。根据国内外的报道，该酶可广泛用于黄酮类物质的生物转化。
微生物发酵产酶是生物酶来源的一个有效途径。国内外的研究表明，通过微生物发酵产酶能够水解银杏黄酮苷成银杏黄酮苷元，使苷元活性明显高于银杏黄酮苷。银杏黄酮是目前已发现的最好的防治心脑血管疾病的药物，当前银杏黄酮主要是从银杏叶中提取的，不过从银杏叶中提前的银杏黄酮主要是以银杏黄酮苷的形式存在，而而银杏黄酮苷的生物活性要显著小于银杏黄酮苷元，由于酶法环境友好选择性高，因此有必要利用β‑葡萄糖苷酶把银杏黄酮苷转化为苷元。
目前对于β‑葡萄糖苷酶研究成果虽多，但是大多微生物来源于自然界，来源于传统发酵食品中的鲜有报道。此外，传统酶类对底物选择性差，不能使苷元含量最大化，高选择性水解银杏黄酮苷为苷元的报道还很少。伍毅等采用固定商业β‑葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷，取得了较好结果。但是，利用非商业β‑葡萄糖苷酶水解银杏黄酮苷还极少报道，由于商业β‑葡萄糖苷酶价格昂贵，因此，筛选产水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶的菌株，为银杏黄酮苷元的工业化生产奠定基础，降低转化成本就十分重要。
血栓疾病重影响着人类的健康，据统计，全世界每年至少有1200万患者因血栓性疾病而死亡，中国约有260万。因此溶栓抗栓药物的开发一直是关乎人类健康的热点。目前临床上常用的溶栓抗栓药物有链激酶(Streptokinase，SK)、尿激酶(Urokinase，UK)和组织型纤溶酶原激活剂(type plasminogenactivator，t‑PA)，但这些药物存在给药痛苦、副作用大、价格昂贵、半衰期短等缺点，相比之下，纳豆激酶(Nattokinase，NK)已被证明具有高效的溶栓作用，不仅可以直接降低纤维蛋白原，而且可以促进催化血纤维蛋白溶酶原转化为血纤维蛋白溶酶，增加体内血栓溶解因子的合成。并且纳豆激酶具有可口服、安全、廉价和纤溶性强等优势，成为近年来溶栓类产品的研究热点。
中 国 专 利 数 据 库 中 ，涉 及β‑ 葡 萄 糖 苷 酶 的 专 利 和 申 请 件 很 多 ，例 如ZL2014106023384号《一种β‑葡萄糖苷酶和β‑葡萄糖苷酶突变体及应用》、ZL2015101756557号《高耐受性β‑葡萄糖苷酶及其应用》、2017102790450号《一株产水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶产生菌及其筛选方法》等；但未见涉及解淀粉芽孢杆菌GZU05的申请件。
3.发明内容
本发明旨在提供一株产纳豆激酶和β‑葡萄糖苷酶解淀粉芽孢杆菌GZU05：该菌株对发酵豆豉所产的选择性水解银杏黄酮苷的β‑葡萄糖苷酶和产纳豆激酶对防治心脑血管疾病都具有重要作用。
4.发明优点
本发明与现有技术相比，具有以下优点：
①本发明制备的生物复合酶对底物银杏黄酮转化的加标回收率可达88％，β‑葡萄糖苷酶对底物银杏黄酮的转化率可达45％；且发酵方法工艺与原材料简单，降低β‑葡萄糖苷酶的生产成本；且酶对环境耐受力较此前文献中报道的β‑葡萄糖苷酶显著提高：耐受pH2 .8～5 .5，耐受温度40℃～70℃；且转化反应可连续进行，适合大规模连续化生产；
②本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU05的β‑葡萄糖苷酶酶活为4 .022U/g，纳豆激酶酶活力为5786 .1±510 .9，具有将银杏黄酮苷转化为苷元的的作用。且所生产的纳豆纳豆激酶酶活力高，且感官性能良好，易于被大众接受；
③本发明的解淀粉芽孢杆菌GZU05，可用来高值化转化银杏黄酮苷而且可生产高值的纳豆激酶，同时提供了一种新的生产β‑葡萄糖苷酶、纳豆激酶的培养方法，且安全性高；由于黄豆来源广泛，价格适中，降低β‑葡萄糖苷酶、纳豆激酶的生产成本。因此该解淀粉芽孢杆菌具有很好的应用前景。
5.实用性对照实验
实施例1：纳豆激酶酶活力测定
纳豆激酶酶活力定义：用游标卡尺测定溶解圈的直径并计算各溶解圈面积，根据尿激酶标准曲线回归方程计算样品纳豆激酶酶活。
尿激酶标准曲线的制作：将尿激酶标准品分别配制为248IU/m L、496IU/m L、744IU/m L、992IU/m L和1240IU/m L，各取10μL点样于新配制的纤维蛋白原平板孔中(4孔为1组平行)，放置10min，37℃下培养16h后取出，测定溶解圈的直径，计算各溶解圈面积；以溶解圈的面积(x，mm2)为横坐标，以尿激酶酶活(y，IU/mL)为纵坐标，绘制尿激酶标准曲线。线性回归方程为y＝4 .2016x+10 .874，R2＝0 .9994(附图1)。然后测GZU05发酵纳豆的纳豆激酶活力为6861U/g。
实施例2：紫外分光光度法精密测定纳豆激酶：
紫外分光光度计法是由日本纳豆激酶协会建立的种能准确反应纳豆激酶纤溶活性的测定方法，也是世界公认的纳豆激酶活性测定方法之一。该方法的优点在于能客观得出纳豆激酶纤溶活性含量，且能同时检测多种样品。由于琼脂糖—纤维蛋白原平板法测定值易随培养时间、平板厚度的变化而变化，精确度较差不适合精确度要求高的样品测定。具体方法为：向试管中加入1 .4mL Tris‑HCl(50mM，pH 7 .8)缓冲液和0 .4mL纤维蛋白原溶液(7 .2mg/mL)，37℃温育5min后加入0 .1mL凝血酶(20U/mL)，再37℃下温育10min形成人工血栓，加入0 .1mL的待测样品，37℃下温育60min，加入2mL三氯乙酸(0 .2moL/L)溶液静置20min终止反应，13000r/min离心10min，取上清液于275nm波长处测定吸光度。酶活定义：每1min于275nm处吸光度增加0 .01所需要的酶量定义为1个单位的纤维蛋白降解酶活力。按紫外分光光度法精密测定GZU05固态发酵纳豆36h后的纳豆激酶的的纳豆激酶活力达到116FU/g。
6.实体转化
通又通•纳豆胶囊
本品是以纳豆、色拉油、维生素E为主要原料制成的保健食品，经功能试验证明，具有调节血脂的保健功能。
【产品名称】博思牌纳豆胶囊
【主要原料】纳豆、色拉油、维生素E
【功效成分及含量】每100g含：大豆异黄酮50mg、粗多糖（以葡聚糖计）5g、维生素E 138mg、亚油酸38g
【保健功能】调节血脂
【适宜人群】血脂偏高者
【不适宜人群】少年儿童
【食用方法及食用量】每日2次，每次3粒
【规格】600mgx30粒/瓶
【保质期】24个月
主要功能：溶血栓，通血管，调血脂，三高，改善血液循环。
产品特色：
（1）：蓝帽产品，有国家食品药品监督管理局颁发的保健食品批文、可标注保健功能；
（2）：有中国科学院过程工程研究所（专利受理号202210708168.2）牵头研发；
（3）两大发明专利加持：一种纳豆激酶微囊的制备方法（专利号：ZL201911413708.9）；
一株产纳豆激酶和β-葡萄糖苷酶解淀粉芽孢杆菌GZU05及其应用方法（ZL201910025309.9）。
（4）选用低温冻干纳豆粉，浓缩提炼专利技术，采用纳豆激酶微囊包裹确保纳豆激酶的高活性、高含量，吸收率高达99%；
（5）：纳豆激酶含量高达50000IU,高活性，高含量；
（6）：采用双重包膜软胶囊，无纳豆特殊异味，好吞服，无惧胃酸，好吸收，24小时高活性；
（7）：去除维生素K2，和嘌呤，痛风人群也可以放心服用。
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