嫦娥科研速报｜一种Cathepsin L抑制组合物在细胞扩增中的用途-获发明授权
专利名称：一种Cathepsin L抑制组合物在细胞扩增中的用途
专利号：ZL 2023 1 0012508.2
专利摘要：本发明制备获得了重组CathepsinL蛋白，将所述蛋白免疫小鼠制备获得了相应的单克隆抗体，所述抗体具有较好的结合和抑制蛋白活性的能力同时能够抑制肝癌的活力，在制药领域具有广阔的应用前景。
专利核心：重组Cathepsin L蛋白；单克隆抗体；抑制蛋白活性；抑制肝癌活力
专利介绍：
1.技术领域
本申请涉及生物领域，更具体的涉及一种Cathepsin L抑制组合物在细胞扩增中的用途。
2.背景技术
组织蛋白酶(cathepsin)在1920年由Lanner首次发现，它广泛存在于动物各种组织细胞内，在维持动物正常生命活动中扮演着重要角色。根据酶的催化机制，组织蛋白酶分为以下4大类:金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶和半胱氨酸蛋白酶。除此之外，还有谷氨酸蛋白酶、苏氨酸蛋白酶和一些尚未进行分类的蛋白酶。根据组织蛋白酶代表底物还可以分为L、B1、D、E、F、FG、GF、G、H、S等几大类。
Cathepsin L是半胱氨酸蛋白酶家族的重要成员之一，广泛分布于人体各种组织细胞的溶酶体中。CathepsinL的蛋白分子量为30KD，当溶酶体膜不稳定时可释放至胞浆，被溶酶体中其他的蛋白水解酶激活或自身激活，形成24KD的活性形式。Cathepsin L主要功能是降解各种组织蛋白，水解某些前体蛋白(酶原和激素原)，生成其活性形式，或激活其他蛋白水解酶系统，从而参与机体的多种生理活动，如抗原递呈、激素前体的活化、骨基质的降解等。中枢神经系统中，Cathepsin L主要由激活的小胶质细胞产生和释放。
溶酶体CTSL是多种肿瘤疾病中的标志物和潜在治疗靶标的蛋白水解酶。根据研究表明，癌细胞通过分泌蛋白酶降解细胞外膜成分，从而促进肿瘤的侵袭和转移。对3种鼠黑素瘤变体的观察发现，癌细胞通过CTSL mRNA的持久翻译来维持CTSL的高表达水平，而肿瘤细胞本身就是CTSL mRNA表达升高的来源。测定肿瘤相邻的非恶性组织和远离肿瘤的非恶性组织的匀浆中几种蛋白酶样肽酶的活性，发现肿瘤相邻的A‑NM中CTSL的活性显着高于D‑NM组织。与正常组织相比，在胃癌、结直肠癌、乳腺癌和甲状腺癌中，也有CTSL酶活性增加的报道，这提示CTSL表达上调与疾病进展有密切关系。同时研究发现CTSL参与卵巢癌细胞的增殖和侵袭，CTSL在卵巢癌(ovariancancer，OC)中过度表达，CTSL的下调则能显著抑制了人卵巢癌细胞(skov3)的增殖和侵袭能力，而CTSL在ov90细胞中的上调则会产生相反的效果。与OC细胞相比，在裸鼠体内CTSL沉默细胞发育成肿瘤的能力降低，而这些细胞的异种移植瘤生长明显受到抑制。大量文献资料表明癌症组织CTSL的表达水平显著高于正常组织，其中肾和睾丸肿瘤表达的CTSL水平最高，多数乳腺癌表达的CTSL水平较高。CTSL的过表达与人类动脉粥硬化和主动脉瘤(aorticaneurysm，AA)的发生发展同样有着密切联系。重组半胱氨酸蛋白酶抑制剂C具有较高的抗蛋白酶活性，主要通过抑制CTSL活性，达到抑制癌细胞的生长和侵袭的效果。在主动脉瘤中，当不存在半胱氨酸蛋白酶抑制剂C时，CTSL的活性增强，促进了微血管形成、细胞凋亡、白细胞黏附及细胞增殖，从而导致AA病变面积的增大以及动脉管腔直径增大。因此CTSL和半胱氨酸蛋白酶抑制剂C可能与AA存在相关关系。以CTSL结构特点为治疗肿瘤的突破点，中国科学家发现阿斯非芬酯及其类似物能与CTSL形成氢键，与其紧密结合，从而抑制癌细胞的增殖和迁徙。总之，通过敲除卵巢癌细胞和乳腺癌细胞的CTSL基因来减少肿瘤细胞的增殖、迁移和侵袭，增强胶质瘤细胞对放射治疗敏感性。
目前，针对Cathepsin L抑制剂主要包括Clik148、Z‑FY‑DMK等几种类型，但是针对Cathepsin L生物类的抑制剂特别是Cathepsin L单克隆抗体的研究还不够多。
3.发明内容
本发明针对现有技术的缺陷，提供一种特异性的Cathepsin L蛋白单克隆抗体；进一步的，本发明还提供了Cathepsin L蛋白单克隆抗体在制备用于抑制癌细胞增殖的药物组合物中的用途；本发明的药物组合物还包含药学上可接受的载体以及第二治疗剂。
4.发明优点
本发明制备获得了重组Cathepsin L蛋白，将所述蛋白免疫小鼠制备获得了相应的单克隆抗体，所述抗体具有较好的结合和抑制蛋白活性的能力同时能够抑制肝癌的活力，在制药领域具有广阔的应用前景。
5.实用性对照实验
实施例1：C7I6单克隆抗体对癌细胞的抑制作用
将SMMC‑7721肝癌细胞冻存管在37℃温水中快速摇晃融化，时间1min左右，加入4‑5ml培养基混匀。在1000RPM左右条件下离心4min，弃上清 ,加1‑2ml DMEM/F12培养基吹匀，将细胞悬液加入培养瓶中，补加适量培养基。细胞密度达到80‑90％时即可传代，弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1‑2次；加入2ml0 .25％胰酶(T25瓶)，使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；1‑2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6‑8ml培养基；悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。带细胞长到对数生长期，调整细胞浓度为1×105个/ml，接种于96孔培养板中，每孔100μl，分别加入终浓度为0、10、20、50、100、200μg/mL的单克隆抗体，设置阳性对照为50μg/mL盐酸吉西他滨，处理24h。弃上清，每孔加入MTT 10mg/ml 20μl，4h后弃去液体，每孔加入二甲基亚砜150μl，震荡10min，酶标仪测490nm处吸光度值，各孔吸光度值减去空白空吸光度值得到实际吸光度值。结果如表1所示：
表1肝癌细胞MTT细胞活力检测结果
从表1的结果可以看出，本发明的单克隆抗体具有剂量依赖性的降低细胞活力的效果，并且与空白组相比差异极其显著(P<0 .01)。与阳性对照组相比，本发明的单克隆抗体具有更好的抑制细胞活力的效果，可以在癌症治疗中具有更重要的应用。
将各组处理后的细胞，提取细胞总蛋白，进行蛋白含量检测，常规法进行WB检测，化学发光法显色，统计Cathepsin L/GAPDH比值，结果如图3所示。从图3可以看出。本发明的单克隆抗体能够较好的抑制Cathepsin L蛋白的表达，而阳性对照对该蛋白的影响较好。这说明，本发明的单克隆抗体能够特异性的抑制Cathepsin L的表达，抑制率大于88％，效果显著。
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