嫦娥科研速报｜一种纳豆激酶微囊的制备方法-获发明授权，已实现实体转化

专利名称：一种纳豆激酶微囊的制备方法

专利号：ZL 2019 1 1413708.9

专利摘要：本发明所述的纳豆激酶微囊的制备方法，能大大提高纳豆激酶的包封率，提高纳豆激酶微囊的稳定性，让纳豆激酶的活性和含量得以大限度保留，从而变相提高了其生物利用度，高活性，高含量的纳豆激酶，可以溶栓，激活增强人体自身的溶栓能量，持续平稳的溶栓，有效的调理血脂，平衡血压。

专利核心：植物多酚；脂肪酰氯；二氧六环；纳豆激酶微囊

专利介绍：

1.技术领域

本发明属于医药剂型技术领域，涉及一种微囊的制备方法，具体为一种纳豆激酶微囊的制备方法。

2.背景技术

纳豆激酶(nattolinase ,NK)最早于1987年由日本科学家须见洋行博士发现并命名，是从日本传统发酵食品纳豆中提取出的一种具有强烈纤维蛋白溶解活性的丝氨酸蛋白酶。纳豆激酶是一种碱性蛋白酶，由275个氨基酸组成，分子量约为28kDa，其序列与枯草芽孢杆菌蛋白酶相似。纳豆激酶可以直接溶解纤维蛋白，而血栓是由血小板和纤维蛋白堆积而成，纳豆激酶可以溶解纤维蛋白，进而对血栓及其相关疾病，如冠心病、心绞痛及脑中风等有一定预防及治疗作用。纳豆激酶在温度低于45℃时相对稳定，高于60℃则迅速失活，反复冻融5次仍保持95％以上的活性，在pH为6‑12稳定，其最优pH为10 .3‑10 .8，在酸性条件下无活性。纳豆激酶在胃酸环境中经历2～3小时内仍保存约30％的活性，但是在4小时后基本失活。因此纳豆激酶从口入，经过胃肠道，到达小肠吸收，只有小部分能被人体利用，生物利用度低。

人们对植物多酚的认识过程有着较长的历史。植物多酚具有许多活泼位点，赋予它一系列独特的化学性质，其中植物多酚与蛋白质的结合是其最重要的特性之一。多酚与蛋白质的结合分为可逆性和不可逆性，可逆性的结合就是一些非共价作用，包括氢键作用、静电吸附和疏水作用等。例如鞣酸蛋白服后在胃内不分解，在肠内被分解出鞣酸而使肠内表层的蛋白质沉淀，形成一层蛋白膜而减轻刺激，减少炎症渗出物而起收敛止泻作用。药用蛋白和植物多酚脂肪酸酯以氢键紧紧结合在一起形成网状结构，构建微囊剂型的目的在于提高药用蛋白的生物利用度，保持药用蛋白的疗效，同时实现药用蛋白在肠道体系中的pH敏感并且可调控的释放，提高药用蛋白的应用价值。

目前关于纳豆激酶微囊的制备方法主要有喷雾干燥法、悬浮包衣法、挤压法、超分子包合物法等，但以上方法往往难以实现包封率高，载药量大的目的，如何能够高效、长时间的保持纳豆激酶的活性研究还处于空白阶段。

3.发明内容

为了解决现有的纳豆激酶包封率低，微囊不稳定的问题，本发明提供了一种纳豆激酶微囊的制备方法，纳豆激酶最终被植物多酚脂肪酸酯包裹在内，保证纳豆激酶微囊酶活稳定性高，储存时间长，使纳豆激酶能够克服首过效应，增加纳豆激酶在小肠的吸收，提高其抗血栓作用，使生物利用度大大提高。

4.发明优点

本发明所述的纳豆激酶微囊的制备方法，能大大提高纳豆激酶的包封率，提高纳豆激酶微囊的稳定性，从而变相提高了其生物利用度。

多酚能与蛋白质结合的形成稳定的复合体，植物多酚是偏酸性，而纳豆激酶偏碱性(等电点是8 .6)，相比其它的蛋白类药物植物多酚与纳豆激酶更具有结合稳定的特性，从而实现纳豆激酶在胃液中保持稳定活性且能实现在小肠中的释放。

5.实用性对照实验

（1）纳豆激酶微囊-1制作

步骤①：取地榆素2g与3‑甲基脂肪酸氯3 .2g，氢氧化钠4 .8g，二氧六环20mL，氮气保护下100℃反应3h，产物用石油醚溶解并用饱和食盐水洗涤，减压蒸馏除去石油醚得到地榆素‑(3)‑甲基脂肪酰氯复合物，烘干保存即可。

步骤②：按照地榆素‑(3)‑甲基脂肪酰氯复合物、肉豆蔻酸异丙酯、纳豆激酶冻干粉和水的质量比为1:20:2:77，取步骤1所得产物3g、肉豆蔻酸异丙酯60g、纳豆激酶冻干粉6g和水231g混合后经超声细胞破碎仪均质1min，得到包埋纳豆激酶的W/O型乳液。

步骤③：取乳液100mL加到分子蒸馏设备的进料器，高真空蒸馏法中蒸馏温度为50℃，冷凝面温度为20℃，料液流速为4mL/min，高真空蒸馏时间为15min，压力为100Pa，得到纳豆激酶微囊。

（2）纳豆激酶微囊-2制作

步骤①：取2g肉桂多酚与4g己酰氯，氢氧化钠4g，二氧六环20mL，氮气保护下100℃反应4h，产物用石油醚溶解并用饱和食盐水洗涤，减压蒸馏除去石油醚得到肉桂多酚‑己酰氯复合物，烘干保存即可。

步骤②：按照肉桂多酚‑己酰氯复合物、三油甘脂、纳豆激酶冻干粉和水的质量比为2:25:3:70，取步骤1所得产物6g、三油甘脂60g、纳豆激酶冻干粉9g和水210g混合后经超声细胞破碎仪均质1min，得到包埋纳豆激酶的W/O型乳液。

步骤③：取乳液100mL加到分子蒸馏设备的进料器，高真空蒸馏法中蒸馏温度为60℃，冷凝面温度为23℃，料液流速为6mL/min，高真空蒸馏时间为22min，压力为130Pa，得到纳豆激酶微囊。

（3）纳豆激酶微囊-3制作

步骤①：取1g芦荟大黄素与3g辛酰氯，氢氧化钠3 .5g，二氧六环20mL，氮气保护下100℃反应5h，产物用石油醚溶解并用饱和食盐水洗涤，减压蒸馏除去石油醚得到大黄素‑辛酰氯复合物，烘干保存即可。

步骤②：按照大黄素‑辛酰氯复合物、玉米油、纳豆激酶冻干粉和水的质量比为3:30:2:67，取步骤1所得产物9g、三油甘脂90g、纳豆激酶冻干粉6g和水201g混合后经超声细胞破碎仪均质1min，得到包埋纳豆激酶的W/O型乳液。

步骤③：取乳液100mL加到分子蒸馏设备的进料器，高真空蒸馏法中蒸馏温度为80℃，冷凝面温度为27℃，料液流速为6mL/min，高真空蒸馏时间为20min，压力为150Pa，得到纳豆激酶微囊。

（4）纳豆激酶微囊的包封率测试

包封率％＝微囊中纳豆激酶的含量/原始加入的纳豆激酶含量×100％

表1：实施例中纳豆激酶的包封率结果：

（5）纳豆激酶微囊的抗血栓效果测试

取SD大鼠60只，随机分为6组，每组10只。实验组1、2、3、4，纳豆激酶冻干粉对照组以及空白对照组。实验组1、2、3、4分别给药实施例1、2、3、4中的纳豆激酶微囊，采用灌胃给药，将纳豆激酶微囊和纳豆激酶冻干粉制备出混悬液。实验组给予同等体积的纳豆激酶微囊混悬液，纳豆激酶冻干粉对照组给予同等体积的纳豆激酶冻干粉混悬液，空白对照组给予同等体积的蒸馏水。每天1次，连续7天。

大鼠用1％戊巴比妥钠5mL/kg腹腔注射麻醉后，右颈总动脉取血测试大鼠体内动脉血栓形成时间。

表2：大鼠体内动脉血栓形成时间测试结果：

实施例结果与对照组相比，本发明的具有抗血栓效果的纳豆激酶微囊能有效地延长血栓的形成时间，降低模型大鼠的血栓重量，对血栓形成有明显的抑制作用。

6.实体转化

• 通又通•纳豆胶囊
  

本品是以纳豆、色拉油、维生素E为主要原料制成的保健食品，经功能试验证明，具有调节血脂的保健功能。

【产品名称】博思牌纳豆胶囊

【主要原料】纳豆、色拉油、维生素E

【功效成分及含量】每100g含：大豆异黄酮50mg、粗多糖（以葡聚糖计）5g、维生素E 138mg、亚油酸38g     

【保健功能】调节血脂

【适宜人群】血脂偏高者     

【不适宜人群】少年儿童

【食用方法及食用量】每日2次，每次3粒

【规格】600mgx30粒/瓶

【保质期】24个月

主要功能：溶血栓，通血管，调血脂，三高，改善血液循环。

产品特色：

（1）：蓝帽产品，有国家食品药品监督管理局颁发的保健食品批文、可标注保健功能；

（2）：有中国科学院过程工程研究所（专利受理号202210708168.2）牵头研发；

（3）选用低温冻干纳豆粉，浓缩提炼专利技术，采用纳豆激酶微囊包裹确保纳豆激酶的高活性、高含量，吸收率高达99%；

（4）：纳豆激酶含量高达50000IU,高活性，高含量；

（5）：采用双重包膜软胶囊，无纳豆特殊异味，好吞服，无惧胃酸，好吸收，24小时高活性；

（6）：去除维生素K2，和嘌呤，痛风人群也可以放心服用。

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