嫦娥抗菌肽的研究现状与前景

1、抗菌肽的分类及性质

抗菌肽作为天然免疫系统的第一道防线，经过漫长的进化，对病原微生物具有很好的防御作用。自上世纪70年代末在北美天蚕中发现第一个基因编码的抗菌肽 ( 天蚕素 )以来，已经在植物、动物、微生物中发现了上千种的各种各样的抗菌肽。天然抗菌肽是由基因编码核糖体翻译的小分子多肽，具有广谱抗微生物活性，包括细菌、真菌、病毒。由于其杀菌机制不同于传统抗生素，细菌不易对其产生耐药性。除了直接的杀菌活性外，部分抗菌肽分子还能促进伤口愈合，选择性地杀伤肿瘤细胞，这些特点使抗菌肽成为非常有前景的抗感染候选药物。

1980年，Boman实验室第一次分离得到天然抗菌肽-从惜古比天蚕蛹中得到了昆虫抗菌肽 cecropin，Zasloff从非洲爪蟾皮肤中分离到两栖类的抗菌肽分子magainins。到目前为止，已经有超过 2000 种天然抗菌肽分子在不同的物种中被发现。在已经发现的天然抗菌肽中，大多数都具有相同的特征，比如：都是小肽分子 (9-50 个氨基酸 )；带有不同量的正电荷，序列中的疏水氨基酸和阳离子氨基酸构成两亲性结构。

在哺乳动物中主要存在两类天然抗菌肽分子：cathelicidins和defensins。Cathelicidins已经在鱼类，鸟类，两栖爬行类，哺乳动物中发现。Cathelicidin的cDNA序列由三个部分组成：信号肽序列，cathelin保守区域，以及成熟的C端cathelicidin区段。Cathelin样区段保守区域因与半胱氨酸蛋白酶抑制剂cathelin的氨基酸序列相似度很高，因而得名。Cathelicdins抗菌肽在其前体蛋白的N端有一段高度保守的被称为cathelin的结构域，成熟的cathelicidins主要通过组织蛋白酶3作用于其前体蛋白释放出来的。不同物种间的cathelicidins成熟肽序列具有很低的相似度，但是几乎都是α-螺旋线性分子。

在人类中只有一个cathelicidin基因被发现，其具有抗菌功能的成熟肽 LL37 是来源于人的中性粒细胞和其它细胞 (各种上皮细胞 ) 中储存的hCAP18蛋白的C末端。中性粒细胞受到病源微生物刺激时会快速释放出其颗粒中储存的 hCAP18，同时在丝氨酸蛋白酶(组织蛋白酶 3，弹性蛋白酶)等的作用下释放出具有快速、高效、广谱的抗菌活性的成熟肽LL37。在体内LL37的活性与其能否从hCAP18中释放出来时密切相关的，提高或者抑制中性粒细胞中弹性蛋白酶 (蛋白酶3)，都能显著影响其抗菌活性。在其他物种中一般同时存在多种cathelicidins，而即使是同一个物种中的这些 cathelicidins除了其N端的相似度较高外，其成熟肽序列的相似度也比较低。而且不同物种中的cathelicidins成熟肽的氨基酸组成也有比较大的差异，人源的LL-37富含赖氨酸和精氨酸，猪源的PR39富含脯氨酸与精氨酸，来源于蛇的OH-CATH30富含苯丙氨酸和精氨酸，这些抗菌肽在生理情况下一般都采用α-螺旋的结构存在。

Defensins大量存在于哺乳动物中，根据其二级结构可分为α-defensins, β-defensins和θ-defensins。目前已发现50种α-defensins和90种β-defensins。A-defensins主要存在于中性粒细胞和小肠潘氏细胞中，而β-defensins主要存在于上皮组织。与cathelicidins在人中只有 一种LL37多肽不同的是，到目前为止，6 种β-defensins已经在人的各种组织中被发现。这些defensins基本上具有阳离子特征，抗菌活性，而且所有的defensins都含有6个保守的半胱氨酸残基，可以形成 3 对分子内的二硫键，这些二硫键对维持他们的结构和功能是非常重要的。尽管哺乳类的defensins在氨基酸序列中表现出多样性，但是这六个半胱氨酸残基却非常保守。根据序列同源性和六个半胱氨酸残基的保守性，哺乳类的defensins可以分为α-,β-,和θ-defensins。这六个半胱氨酸残基在α-defensins通过1-6，2-4，3-5连接，在 β-defensins中通过1-5，2-4，3-6连接，而θ-defensins是一种环状的分子。

2、细菌耐药现状

自从上世纪30年代发现第一个β- 内酰胺类抗生素青霉素以来，抗生素对人类健康做出了巨大的贡献，许多细菌感染导致的不治之症都能轻而易举的治愈。从1930-1970年被认为是抗生素药物的黄金年代，在这40年中科研人员先后发现了大量的不同类型的抗生素：链霉素 (1944)，头胞菌素 (1945)，氯霉素 (1947)，金霉素 (1948)，土霉素 (1949)，红霉素 (1951)， 卡那霉素 (1958)，喹诺酮抗生素 (1962)，硫霉素 (1976)，碳青霉烯类抗生素 (1979) 等，其中有许多种抗生素直到今天也在被广泛使用。

随着抗生素的大量使用，尤其是不合理应用，比如：预防性的使用、动物养殖业随意使用等，导致许多细菌都对传统抗生素产生了耐药性。青霉素刚投入临床使用的时候，几乎所有的金黄色葡萄球菌都对其敏感，可是才过了几年就发现了对青霉素耐药的金黄色葡萄球菌。为了解决金黄色葡萄球菌对青霉素的耐药性问题，1961年甲氧西林问世并投入临床使用，不久之后又出现甲氧西林耐药葡菌球菌(MRSA)。从 2003年以来，在美国医院中临床分离出的金黄色葡萄球菌超过50%都是 MRSA。万古霉素一直对 MRSA很敏感，但是90年代后期也出现了对万古霉素耐药的金黄色葡萄球菌。

除了金黄色葡萄球菌，革兰氏阴性菌如大肠杆菌、绿脓杆菌也容易对传统抗生素产生耐药性。1963 年，研究人员在雅典从一株大肠杆菌中首次分离出TEM-1型β-内酰胺酶，随后发现携带TEM-1基因的转座子在全球内各菌株中广泛传播；1983年又发现超广谱β-内酰胺酶 (ESBL)，这种酶能水解三代头孢菌素。现在，革兰氏阴性菌已成为医院感染的主要病原菌。链霉素是第一个有效的抗结核药物，以及后来发现的利福霉素类抗生素，有效地遏制了结核病的蔓延。但是耐药与多重耐药结核杆菌 ( 异烟肼或利福平等单药耐药，也可以对利福平、异烟肼、乙胺丁醇等多药同时耐药) 也随之而来。

限制抗生素的滥用似乎可以减缓细菌耐药性产生的速度，但是在现实中是却很难办到。 我们目前还无法阻止细菌耐药性的产生，只能加快速度研发新的抗生素和新的治疗方法。另人遗憾的是与这些耐药细菌快速大量出现相反的是新型抗生素的短缺。自从上世纪80年代开始，被美国药品食品管理局批准上市的新抗生素逐年递减。并且这些新抗生素中大部分是对已有抗生素结构修饰得来的，具有全新作用机制的抗生素少之又少。从 2000 年以来，只有三种具有全新抗菌机制的抗生素上市：达托霉素 (Daptomycin )，利奈唑酮 (linezolid) 和瑞他帕林 Retapamulin。由于抗生素的开发历时长久，成功率很低，而且每一个抗生素从开发到上市大约要耗费4-8亿美元，导致很多制药公司不愿投资开发抗生素药物。细菌对新上市的抗生素的潜在耐药性也是抗生素开发缓慢的一个重要原因。2010出现的携带有“NDM-1”基因的超级耐药细菌，除了替加环素和多粘菌素，几乎对现有的所有抗生素耐药，迫使各国政府重视新抗生素的开发。

3、抗菌肽的抗菌机制

抗菌肽可通过多种机制导致细菌死亡，其中最主要的是破坏细菌细胞壁和增加细菌细胞膜的通透性。天然抗菌肽对原核生物和真核生物的毒性具有一定的选择性，通常在其发挥抗菌活性的浓度下对真核细胞的毒性比较小。目前认为有以下几个方面的原因：

3.1 原核细胞和真核细胞生物膜的组成、疏水性和电荷差异

磷脂双分子层是所有生物膜中的基础构成成分。这种磷脂双分子层是两亲性的，同时含有亲水性和疏水性成分。原核生物和真核生物在膜的组成上具有比较大的差异。卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)一般不带电荷，鞘磷脂(SM)一种卵磷脂的同源物，也不带电荷。在正常膜系统中，卵磷脂和鞘磷脂是负相关的。非常有意思的是，固醇类在真核生物膜中被发现，但是在原核生物生物膜几乎没有。磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL)和磷脂酰丝氨酸(PS)，带有负电荷。细胞膜主要由磷脂酰甘油(PG)、心磷脂(CL) 和磷脂酰丝氨酸(PS)构成的则带有比较强的负电荷，而大多数细菌细胞膜都主要是由这几类物质构成。相反，哺乳动物细胞质膜大部分是由卵磷脂(PC)和磷脂酰乙醇胺(PE)一般不带电荷，鞘磷脂(SM)构成的，所以基本上是电中性的，正是由于这些差异导致了天然抗菌肽对细菌的专一性比较强。

3.2 细菌膜表面可能存在抗菌肽专一性的结合物
过去的研究表明，L-和D-氨基酸组成的抗菌肽分子同细菌的结合并没有表现出明显的选择性，表明受体可能没有参与抗菌肽同细菌的相互作用，但是某些特有的结构对抗菌肽与细菌的亲和力是非常关键的。

3.3 抗菌肽自身的结构决定的对不同生物膜的选择性毒性

许多α-螺旋的抗菌肽在没有同生物膜接触时是以非固定结构的形式存在的，它们同含有不同膜组分和电荷的细胞膜接触时所形成的结构也是不同。而个别的抗菌肽，靠分子中二硫键形成特定的结构 , 这些抗菌肽的结构不依赖于所接触的膜结构。如plectasin, 第一种蘑菇来源的 defensin，具有三对二硫键，选择性地抑制革兰氏阳性菌。 在已有的研究中提出了许多抗菌肽的抗菌机制模型，包括离子通道模型，孔道模型，抑制蛋白质合成，抑制细胞壁的合成等，其中最流行的是孔道模型。不管是哪种抗菌机制模型，抗菌肽都要经过趋化、吸附、插入细胞质膜三步，最后才是细菌脂膜的破裂和抗菌肽肽进入胞内抑制蛋白质、mRNA等的合成，最终导致病菌死亡。

4、抗菌肽的生物学活性

4.1 对原核和真核细胞选择性毒性
天然抗菌肽是根据其直接的杀菌活性被定义和鉴定出来的，这些阳离子小肽在体外具有高效，广谱的抗微生物活性，包括细菌，真菌，寄生虫，病毒等。目前大部分的天然抗菌肽，尤其是α--螺旋抗菌肽，在体外实验中较高浓度时都能表现出杀菌作用，但是当处于生理盐浓度或者是血清中时，抗菌活性下降得很快。虽然天然抗菌肽对细菌和真核细胞细胞膜有一定的区分能力，但是个别天然抗菌肽在高于其MIC值数倍时，对真核细胞也有一定的毒性，尤其是对红细胞的溶血活性。一般来讲，抗菌活性越强的抗菌肽其溶血活性也相对较高。Melittin，是一种从蜂毒液中分离得到的含有26个氨基酸的抗菌肽，其抗菌活性非常强，对包括细菌，真菌，病毒均有效，但是在其MIC值是同样也对哺乳动物红细胞具有很强的溶血活性。由于肿瘤细胞膜表面一般比正常细胞带有更多的负电荷，在一定浓度范围内，某些抗菌肽分子能够识别这种差异选择性地杀死癌细胞。根据天然抗菌肽的结构特点人工设计的一些抗菌肽分子在体外和体内均表现出了较好的抗肿瘤活性。

4.2 免疫调节活性
由于大部分天然抗菌肽分子在生理条件下的抗菌活性并不强，而且天然抗菌肽分子在体内的生理浓度通常也比较低，个别抗菌分子低于它们的最小抑菌浓度 (MIC)，所以天然抗菌肽分子在体内的作用可能并非简单的直接杀灭病原微生物。越来越多的研究结果表明天然抗菌肽在体内可能主要是通过调节免疫系统来达到抵御病原微生物入侵。LL-37在血清和肺表面等生理条件下，几乎没有抗菌活性，但是敲除小鼠的CRAMP后小鼠对细菌的敏感性提高，同正常小鼠相比，遭受更严重的皮肤感染。LPS 是革兰氏阴性菌细胞壁中的主要构成成分，同时也是一种很强的免疫刺激因子，能够过度激发免疫反应导致多种组织器官坏死，是革兰氏阴性菌感染导致的死亡的一个主要原因。当LPS从死亡的细菌中释放出来后能够同体内的 LPS 结合蛋白 (LBP) 结合，然后同单核/巨嗜细胞上的CD14形成复合体，最后通过TLR4/MD2 激活免疫反应，从而引起一些促炎症因子的表达和分泌。

许多阳离子抗菌肽在体外对 LPS表现出很强的拮抗作用，比如LL-37能够直接同LPS结合，阻止LPS与LBP的结合，同时LL37也能竞争性地结合到CD14上，阻止LPS/LBP/CD14复合物的形成，阻断LPS的免疫激活能力。同时各种阳离子多肽在小鼠 endotoxemia模型中也表现出了较好的保护效果。在临床重度细菌感染病人血清中，低水平的LL-37表达量与死亡率正相关，表明LL37对人体直接的免疫调节作用对抵御细菌感染是非常重要的。LL37在体外能够通过甲酰肽受体诱导白细胞的趋化作用。Cathelicidin家族还能诱导单核/巨噬细胞及各种上皮细胞表达或分泌多种促炎症因子和抗炎症因子。在肺上皮细胞和皮肤表皮细胞通过P2X7受体刺激细胞表达和释放促炎因子IL1b和IL18。IL1b是天然免疫系统中的一种重要细胞因子，能够快速激发天然免疫反应。目前的研究表明快速高效地诱导IL1b的释放对抵御病原微生物的入侵是至关重要的。别的来源的cathelicdins，如牛的indolicidin，羊的SMAP-29都有同LL37相似的免疫调节活性。

4.3 促进伤口愈合

天然抗菌肽还能通过多种机制促进伤口愈合。LL37和hBD2及hBD3在伤口部位的浓度比正常组织中要高很多倍，提示这些抗菌肽分子除了抵抗可能的感染外，还参与了伤口的愈合过程。hBD2能够促进上皮细胞的迁移，增殖以及微管形成，并加速伤口愈合。Cathelicidins在许多研究中也被证明可以影响伤口的愈合过程。最早发现在哺乳动物的皮肤中也存在cathelicdins是通过研究猪的伤口愈合模型被发现的。在这个研究中，PR-39能够增加猪皮肤伤口处的肝素蛋白聚糖1和4，这些肝素蛋白聚糖通过调节肝素结合生长因子来加快细胞的增殖和迁移。LL37 可以通过激活MAPK，pHospHoinositide 3-kinase (PI3K) 以及Akt信号通路，从而增加伤口的愈合。人的LL-37也能通过直接激活FPRL-1促进细胞增殖和促进新血管的生成。LL37还能通过抑制转化生长因子(TGF)诱导的胶原表达，抑制在伤口愈合过程发生的纤维化，这种作用对伤口的正常愈合是有益的。所以天然抗菌肽在伤口处的高表达除了保护动物免予病原微生物感染，同时在伤口的正常愈合过程中发挥了重要的作用。

感染性疾病一直是威胁人类生命、动物生产及其食品安全，上个世纪 30 年代抗生素被发现并广泛地应用于临床治疗, 拯救了无数患者的生命。由于传统抗生素的大量使用导致了耐药病原微生物的迅速增长，因此现在亟待开发出新型抗生素来对付世界范围内日益严重的病原微生物耐药性。抗菌肽在自然界分布广泛，是生物体产生的抵御外源性感染的内源性物质，历经数百万年而很少产生耐受性，具有作用迅速、强大、广谱等特点。因而当其发现之时，就引起了药学界及高科技生物产业界的瞩目。

抗生素的理想替代品——嫦娥抗菌肽

1、抗菌肽的概念和分类

抗菌肽原指昆虫体内经诱导而产生的一类分子量在4KD左右，具有抗菌活性的碱性多肽物质。最初，人们在研究北美天蚕的免疫机制时，发现其滞育蛹经外界刺激诱导后，其血淋巴中产生了具有抑菌作用的多肽物质，这类抗菌多肽被命名为天蚕素 (Cecropins)。后来，从其他昆虫以及两栖类动物、哺乳动物中，也分离到结构相似的抗菌多肽。迄今为止，在不同动物组织中已发现了很多具有抗菌作用的蛋白质和多肽，已有70多种抗菌多肽的结构被测定，抗菌肽的概念得到了极大的扩展。
根据抗菌肽的结构，可将其分为5类：(1)单链无半胱氨酸残基的α-螺旋，或由无规卷曲连接的两段 α-螺旋组成的肽；(2)富含某些氨基酸残基但不含半胱氨酸残基的抗菌肽；(3)含1个二硫键的抗菌多肽；(4)有2个或2个以上二硫键、具有β-折叠结构的抗菌肽；(5)由其它已知功能的较大的多肽衍生而来的具有抗菌活性的肽。其中最早分离到的Cecropins和从非洲爪蟾中分离到的 Magainins等属于第一类抗菌肽，通常也将其称为Cecropin类抗菌肽，目前对此类抗菌肽的研究也较深入。

2、抗菌肽与抗生素的主要区别

由于抗菌肽具有不同于抗生素的特性，使其有极大的潜力成为可替代抗生素的新一类抗菌药物。抗菌肽与抗生素的主要区别在于以下几个方面：

①产生机制不同
传统的抗生素主要是细菌的发酵产物，由酶促反应合成，而抗菌肽则是由宿主基因编码在核糖体上合成的产物。

②杀菌机制不同
传统的抗生素大多数是通过抑制细菌细胞壁或DNA的合成而发挥作用，而抗菌肽主要通过与带负电荷的微生物细胞膜直接作用，改变其通透性，造成膜的物理性损伤，导致细胞内容物外渗而死亡。

③作用方式不同
传统的抗生素作用涉及到和细菌胞膜上或胞内特异的受体结合，且受体类型有限，细菌容易通过变异而产生耐药性，抗菌肽的作用不涉及特定的受体，完全是阴阳离子的物理作用，它可以很快杀灭微生物而不产生耐药性。

3、抗菌肽杀菌作用机理

大多数抗菌肽能穿透脂双层膜，引起跨膜电化学梯度的崩溃，从而丧失了水和离子跨膜运输的能量，最终导致细胞皱缩和裂解。但不同的抗菌肽采用这种机制时具体作用过程并不尽相同。大量的研究表明，抗菌肽直接作用于靶微生物的膜上，其中并无受体介导。“穿孔模型(barraL stave modal)”和“地毯模型(carpet modal)”是目前关于抗菌肽膜活性作用过程的两种最常见的并且被广泛接受的模式。

（1）穿孔模型
首先，由于抗菌肽带正电荷，与细胞膜负电荷相互吸引而结合在细胞膜表面；然后，单体的抗菌肽分子形成多聚体，其疏水基团插到磷脂双分子层，以与膜表面垂直的方式排列，形成横跨细胞膜的离子通道，已经证明，fowlicidin-1中16~23号氨基酸残基和其与脂多糖的结合有重要关系；离子通道一旦形成，外界的水分即可渗入细胞内部，细胞质也可渗透到外部，细胞膜崩解而导致细胞死亡。

（2）地毯模型
与前一种机制相比，抗菌肽并不插人细胞膜内部，同样在电荷作用下，抗菌肽在膜表面的展开，像地毯平行排列在细胞膜表面；在疏水作用和分子张力作用下改变细胞膜的表面张力，从而在细胞膜上出现暂时的孔洞，除了细胞液的相互渗透，抗菌肽分子也可通过此孔洞进入细胞。

4、展望

利用抗生素很大程度上解决了人们细菌性感染的问题，但是，抗生素的长时间过度使用，使得细菌的抗药性越来越明显，耐药菌朱感染病例也逐渐增多。一方面这导致许多曾经强烈有效的抗生素药物骤然失效，另一方面甚至严重威胁到人类的生命安全。抗菌肽以其独有的抗菌机制和广谱而不产生耐药性的优秀特点，给人类寻找抗菌药物理想品提供了新的思路借鉴，为人类战胜耐药微生物带来了新的机遇，可以说，抗菌肽在未来拥有十分巨大的应用潜力。

抗菌肽在医疗、保健和生物防护领域具有广阔的应用前景。在医疗领域，抗菌肽可以用于治疗感染性疾病，尤其是对于一些耐药菌所致的感染具有重要意义。作为研究和生产美颜肽的嫦娥生物股份，目前对抗菌肽的研究已经进入了临床试验阶段，随着研究的深入，希望嫦娥生物股份能够取得更多的研究成果，为推动抗菌肽的临床应用做出更大的贡献。相信在不久的未来，嫦娥抗菌肽将极大的造福人类。