嫦娥科研速报｜一种以脐带间充质干细胞为基础细胞生产细胞因子的方法-获发明授权
专利名称：一种以脐带间充质干细胞为基础细胞生产细胞因子的方法
专利号：ZL 2022 1 1009863.6
专利摘要：本发明涉及一种以脐带间充质干细胞为基础细胞高效生产细胞因子的方法。本发明制备获得了特异性的抑制Wnt1/β‑catenin通路中Wnt‑1活性的单克隆抗体，该抗体能够促进脐带间充质干细胞向肝样细胞分化，同时分化后的肝样细胞能够高表达富含IL6的细胞因子，所述细胞因子具有较好生物活性，能够用于制备相应的药物，具有广阔的应用前景。
专利核心：IL6；细胞因子；肝样细胞分化；抑制Wnt‑1；单克隆抗体
专利介绍：
1.技术领域
本申请涉及生物领域，更具体的涉及一种以脐带间充质干细胞为基础细胞高效生产细胞因子的方法。
2.背景技术
细胞因子是一大类对细胞间信号传递很重要的蛋白质。它们由多种细胞产生，包括干细胞，免疫细胞，如巨噬细胞、B淋巴细胞、T淋巴细胞和肥大细胞，以及内皮细胞、成纤维细胞和各种基质细胞。细胞因子的释放将对周围细胞活动产生影响。细胞因子可包括白细胞介素、干扰素、生长因子、肿瘤坏死因子、趋化因子和集落刺激因子。
白细胞介素(Interleukins)又简称为ILs，是一种细胞因子，在调控细胞进程(细胞生长、分化和移动)和刺激免疫反应方面起着重要作用。最初是在白细胞中发现，目前发现它们可由许多种细胞产生，包括巨噬细胞、淋巴细胞等具有实体结构和功能的细胞。干扰素 (Interferon)简称IFN，是宿主细胞针对多种存在的病毒制造并释放出一组信号蛋白，因其能保护细胞免受病毒感染，“干扰”病毒复制而得名。干扰素属于一大类细胞因子的蛋白质， 用于细胞之间沟通，以触发免疫系统的保护性防御，来消灭病原体。生长因子也属于一种蛋 白质或是类固醇激素，为天然存在物，能刺激细胞的生长、分化、生存、炎症和组织修复。生长因子对调节不同的细胞进程有重要的作用，可由邻近细胞、远处组织和腺体，甚至肿瘤细胞本身分泌。正常细胞通过表现出对几种生长因子的需求，来维持增殖和生存能力。生长因子可通过内分泌、旁分泌或自分泌机制发挥其刺激作用。
目前细胞因子的生产方法有很多种。比如CN106520689A提供了一种间充质干细胞细胞因子的制备方法； CN106367389A中公开了一种人脐带间充质干细胞因子的制备方法；CN105543313A中公开了一种分离纯化人源间充质干细胞因子的方法；但是所述方法针对细胞因子IL‑6的产量并都不高。
由于白介素6(interleukin 6，IL‑6)，是与炎症相关最为典型的细胞因子。它通过调节免疫和炎症反应，在宿主防御中发挥着重要作用。IL‑6是一个小分子糖蛋白，分子量为19‑28kDa，由184个氨基酸形成四个α螺旋结构，通常以单体形式存在，等电点为5.0。
IL‑6也是一种具有多效活性的细胞因子，可以促进多种细胞的增殖和分化，也可以加速肝细胞急性期蛋白的合成，还可以抑制M1髓性白血病细胞系的生长，促进其成熟和分化，抑制黑素瘤、乳腺癌细胞的生长。因此，高效生产IL‑6细胞因子是目前研究的迫切方向。
3.发明内容
本发明提供了一种高效生产IL‑6及其他细胞因子的方法。
具体的，本发明提供一种生产含有IL‑6细胞因子的细胞因子混合物的方法。
Wnt‑1蛋白是由343个氨基酸组成分泌型糖蛋白，多数通过细胞表面Frizzled家族受体发挥作用，在胚胎正常发育过程中是必不可少。Wnt‑1的激活会引起复杂的级联信号反应，最终导致多个基因表达上调。Wnt‑1参与了人体多种细胞进程，并影响某些系统的正常功能。Wnt1/β‑catenin通路中Wnt‑1是最重要的调控蛋白。通过抑制Wnt‑1的活性，能够整体上抑制Wnt1/β‑catenin通路。
一方面，本发明提供了一种抑制Wnt‑1的活性的单克隆抗体。
进一步的，本发明还提供了抑制Wnt‑1的活性的单克隆抗体在制备促进脐带间充质干细胞分化为肝样细胞的试剂中的用途。
进一步的，本发明还提供了将分化后的肝样细胞用于生产富含IL6的细胞因子的方法。
进一步的，本发明还提供了制备获得的富含IL6细胞因子用于制备促进成纤维细胞增殖、用于治疗癌症等相关疾病的药物中的用途。
进一步的，本发明制备的细胞因子可用于制备细胞因子制剂、化妆品等。
4.发明优点
本发明制备获得了特异性的抑制Wnt1/β‑catenin通路中Wnt‑1活性的单克隆抗体，该抗体能够促进脐带间充质干细胞向肝样细胞分化，同时分化后的肝样细胞能够高表达富含IL6的细胞因子，所述细胞因子具有较好生物活性，能够用于制备相应的药物，具有广阔的应用前景。
5.实用性对照实验
实施例1：分化后的细胞生产含有人IL6的细胞因子组合物
采用单抗诱导分化后的肝样细胞以5×103/cm2的密度接种15mL含10％胎牛血清的α‑MEM培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养5d，测量细胞密度，4℃低温1500rpm离心5min去掉细胞，上清液冷冻干燥，即得细胞因子组合物，‑20℃保存。
取第4代生长状态良好的hUC‑MSCs以5×103/cm2的密度接种15mL含10％胎牛血清的α‑MEM培养基，置于37℃、5％CO2、饱和湿度培养箱中培养5d，测量细胞密度，并4℃低温1500rpm离心5min去掉细胞，上清液冷冻干燥，即得细胞因子组合物，‑20℃保存。
采用ELISA检测试剂盒测定相同细胞密度条件下的IL6的分泌量。结果如表1所示。
表1 IL6的分泌量
从表1的结果可以看出，相比对照组，采用Wnt‑1‑15C单抗增强诱导后得到的细胞能够高浓度的分泌IL‑6，差异及其显著(P<0 .01)，在1×105个细胞浓度下，可以分离产生(263.42±10.81)pg/mL的IL‑6。
实施:2：细胞因子活性检测
人皮肤成纤维细胞HFF‑1细胞培养于10％胎牛血清的DMEM/F12培养液中，在温度37℃、浓度5％CO2的饱和湿度培养箱中进行常规培养，细胞长至85％时用胰酶消化、传代培养。取对数生长期的HFF‑1细胞，每孔1×104个细胞接种于96孔培养板。12小时后，更换为含有终浓度0μg/mL、10μg/mL、50μg/mL、100μg/mL干细胞因子(实施例1方法制备)的完全培养基，以100μg/mL干细胞因子(实施例1对照组方法制备)的完全培养基作为实验对照，继续培养48h后，每孔加入5mg/ml的CCK‑8溶液20μL，温度37℃避光继续孵育4小时，然后除去每孔培养液，加入DMSO 150μl，震荡混匀，充分溶解。酶标仪检测570nm波长处的吸光度OD值，以0μg/mL为空白对照孔，按照如下公式计算：增殖率(％)＝(OD实验孔‑OD空白对照孔)/OD空白对照孔×100％。结果如图2所示。
图2
从图2结果可以看出，本申请采用单抗诱导的细胞产生的细胞因子具有浓度相关性，随着浓度的增加，可以显著促进人皮肤成纤维细胞的增殖(与对照组相比，P<0 .05)，且呈现剂量依赖性。在使用单抗诱导的细胞制备的100μg/mL的细胞因子可以将HFF‑1细胞的增殖活性提高到(243 .2±14 .3)％，不使用单抗诱导获得细胞制备的细胞因子将HFF‑1细胞的增殖活性提高(196 .8±10 .5)％，这也说明，使用单抗诱导后，能够显著的提高细胞因子的含量以及活性。
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